研究概述

2026年1月27日，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院路中華研究員團(tuán)隊(duì)在Cell期刊在線發(fā)表題為“AAVLINK:ApotentDNA-recombinationmethodforlargecargodeliveryingene therapy”的研究論文。本研究提出了一種新型AAV大載荷遞送策略AAVLINK，通過Cre/lox介導(dǎo)的分子間DNA重組，突破了傳統(tǒng)AAV載量限制，實(shí)現(xiàn)了大基因及CRISPR工具的高效重建與表達(dá)。

研究表明，AAVLINK相較現(xiàn)有拼接策略具有更高的重建效率和更少的截短副產(chǎn)物，并在Shank3和SCN1A小鼠模型中顯著改善行為缺陷和癲癇表型。此外，團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開發(fā)了Cre表達(dá)顯著降低的AAVLINK2.0，并系統(tǒng)構(gòu)建驗(yàn)證了涵蓋近200個(gè)大基因的遞送資源庫，為大基因缺失相關(guān)疾病的基因治療提供了通用且具轉(zhuǎn)化潛力的平臺(tái)。

導(dǎo)讀

盡管取得了上述進(jìn)展，rAAV載體在基因治療中的應(yīng)用仍面臨挑戰(zhàn)，其中最主要的限制之一是其較小的包裝容量（通常小于5kb），這顯著限制了其對大基因的遞送能力。為解決這一問題，研究者提出了多種策略。由于兩種不同的rAAV載體可以共同轉(zhuǎn)導(dǎo)同一靶細(xì)胞，大基因可被拆分為較小片段，分別由兩個(gè)甚至三個(gè)載體遞送；在共轉(zhuǎn)導(dǎo)后，這些片段可在細(xì)胞內(nèi)重組為全長基因或蛋白。目前用于AAV載荷重組的策略主要分為三類：DNA轉(zhuǎn)剪接、RNA轉(zhuǎn)剪接以及蛋白轉(zhuǎn)剪接。然而，DNA和RNA層面的策略通常僅表現(xiàn)出中等或較低的重建效率；而蛋白轉(zhuǎn)剪接則高度依賴正確的蛋白折疊和特定的拆分位點(diǎn)，同時(shí)未連接的蛋白片段持續(xù)存在，可能引發(fā)顯性負(fù)效應(yīng)。

在本研究中，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種名為AAV with translocation linkage（AAVLINK）的方法，用于利用AAV遞送超大基因載荷。該方法具有極高的重建效率、對多種拆分位點(diǎn)的優(yōu)異靈活性，并且?guī)缀醪划a(chǎn)生截短蛋白。研究團(tuán)隊(duì)利用AAVLINK成功挽救了Shank3和Scn1a突變小鼠的疾病表型。此外，AAVLINK還實(shí)現(xiàn)了多種基于CRISPR-Cas9工具的高效遞送。為降低Cre潛在的毒性風(fēng)險(xiǎn)，本研究進(jìn)一步構(gòu)建了帶有降解標(biāo)簽Cre的AAVLINK2.0系統(tǒng)。最后，研究團(tuán)隊(duì)建立了一個(gè)資源庫，涵蓋193個(gè)與遺傳性疾病相關(guān)的大基因以及5種CRISPR工具。

研究結(jié)果

1. AAVLINK的設(shè)計(jì)與優(yōu)化

為提高rAAV基因組重組效率，本研究利用位點(diǎn)特異性的Cre-loxP系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)rAAV基因組之間的精確分子間重組。雙載體體系中，一個(gè)載體包含啟動(dòng)子、目標(biāo)基因（GOI）5′端、剪接供體（SD）及l(fā)ox位點(diǎn)；另一個(gè)載體包含啟動(dòng)子、Cre、嵌入人工內(nèi)含子的lox位點(diǎn)、GOI 3′端及poly(A)信號。當(dāng)兩載體共同進(jìn)入靶細(xì)胞后，首先產(chǎn)生Cre（步驟1），隨后Cre介導(dǎo)重組將“GOI 5′端-SD”與“剪接受體（SA）-GOI 3′端”連接，并使Cre表達(dá)盒與SA及3′poly(A)分離，從而限制其后續(xù)表達(dá)（步驟2）；最終經(jīng)內(nèi)含子剪接實(shí)現(xiàn)全長GOI的重建與表達(dá)（步驟3）（圖1A）。

為降低Cre介導(dǎo)易位的可逆性，研究采用左右臂帶突變的不對稱lox位點(diǎn)（LE與RE）。LE與RE之間的重組會(huì)產(chǎn)生一個(gè)野生型loxP位點(diǎn)以及一個(gè)雙臂突變的lox位點(diǎn)，使該結(jié)構(gòu)不再被Cre識別，從而使易位在原則上不可逆（圖1A、1B）。多組突變lox位點(diǎn)比較顯示，loxJT15（LE）與loxJTZ17（RE）的組合具有最高的重組效率（圖1B），并被用于后續(xù)AAVLINK設(shè)計(jì)。

圖1. AAVLINK的設(shè)計(jì)與優(yōu)化。

在AAVLINK體系中，GOI 5′端mRNA含未剪接SD且缺乏poly(A)，而GOI 3′端作為Cre編碼序列后的非翻譯區(qū)轉(zhuǎn)錄，從而顯著降低截短蛋白產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未檢測到截短EYFP；EYFP表達(dá)在約60 h達(dá)到峰值并保持穩(wěn)定，而Cre表達(dá)隨后迅速下降至基礎(chǔ)水平（圖1C、1D）。進(jìn)一步研究表明，拆分的EYFP經(jīng)雙AAVLINK載體遞送后，僅在兩載體共存且Cre存在時(shí)，才能在體外細(xì)胞和小鼠大腦皮層中觀察到熒光信號；在食蟹猴大腦中亦獲得一致結(jié)果（圖1E–1G）。綜上，這些結(jié)果表明AAVLINK能夠在體內(nèi)外高效重建被拆分的基因，并具備DNA重組高效、精準(zhǔn)且副產(chǎn)物極少等優(yōu)勢。

2. AAVLINK實(shí)現(xiàn)三載體基因載荷的成功遞送

為適配超出雙載體容量限制的更大基因，本研究評估了三載體AAVLINK體系的有效性。該體系需要兩對lox位點(diǎn)來組裝被拆分的目標(biāo)基因（GOI）：第一對lox位點(diǎn)介導(dǎo)GOI 5′端與主體序列之間的重組；第二對lox位點(diǎn)在loxJT15和loxJTZ17臂突變的基礎(chǔ)上引入lox2272間隔區(qū)突變，用于將GOI 3′端易位至主體序列下游，從而避免與攜帶野生型間隔區(qū)的lox位點(diǎn)發(fā)生交叉反應(yīng)（圖2A、2B）。

為驗(yàn)證該策略，研究團(tuán)隊(duì)將TagRFP基因拆分為三段并分別裝載至AAVLINK載體中（圖2C）。在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)導(dǎo)后，重組DNA及其mRNA的測序結(jié)果證實(shí)全長TagRFP基因被精確重建；Western blot分析顯示全長TagRFP蛋白高效表達(dá)，且未檢測到截短產(chǎn)物（圖2D）。隨后，將三段TagRFP分別封裝進(jìn)三種rAAV并轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，僅在三載體同時(shí)存在且Cre活性完整時(shí)檢測到TagRFP信號（圖2E）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣表明，TagRFP可在小鼠及食蟹猴大腦皮層中被高效重建（圖2F、2G）。

這些結(jié)果凸顯了AAVLINK在遞送超大基因方面的能力。單個(gè)rAAV基因組容量約為4.7 kb，在去除反向末端重復(fù)序列（ITR）、Cre及調(diào)控元件（如啟動(dòng)子、內(nèi)含子和poly(A)）后，三載體AAVLINK體系可遞送約11 kb的遺傳物質(zhì)，覆蓋了大多數(shù)與人類遺傳性疾病相關(guān)的基因。

圖2. AAVLINK介導(dǎo)的三載體基因載荷遞送。

3. AAVLINK在蛋白重建效率上優(yōu)于intein方法

研究團(tuán)隊(duì)將AAVLINK與常用的intein蛋白重建策略進(jìn)行了系統(tǒng)比較。蛋白轉(zhuǎn)剪接對拆分位點(diǎn)附近序列高度敏感，而AAVLINK對連接位點(diǎn)要求更為靈活，通常僅需一個(gè)共識外顯子AG/G位點(diǎn)，且可通過同義突變進(jìn)一步優(yōu)化。

以熒光素酶為報(bào)告基因，在雙載體體系中對10個(gè)拆分位點(diǎn)進(jìn)行比較（圖3A），AAVLINK在所有位點(diǎn)上均表現(xiàn)出更高效率，其最高信號較intein方法提高23.3±1.3倍，整體提高25.8±10.5倍（圖3B、3C）。進(jìn)一步分析表明，DNA重組效率隨拆分位點(diǎn)變化，而RNA剪接對多數(shù)位點(diǎn)具有耐受性，二者共同決定了AAVLINK的蛋白產(chǎn)量。

圖3. AAVLINK與基于intein的蛋白重建方法對比評估。

在三載體體系中，AAVLINK同樣顯著優(yōu)于intein方法。無論拆分設(shè)計(jì)如何，AAVLINK均實(shí)現(xiàn)更高的熒光素酶重建效率，平均生物發(fā)光信號提高245.5±156.7倍（圖3D–3F），且全長蛋白比例更高、截短產(chǎn)物極少（圖2D）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一優(yōu)勢。采用相同拆分位點(diǎn)將攜帶拆分熒光素酶的rAAV注射至小鼠體內(nèi)，4周后AAVLINK的整體效率約為intein方法的4.5±1.4倍（圖3G–3I）。

在疾病相關(guān)大基因驗(yàn)證中，針對Shank3（5.4 kb），AAVLINK的重建效率較intein方法提高36.6±22.1倍，且?guī)缀醪划a(chǎn)生截短產(chǎn)物（圖3J–3M）。對于更大的CEP290（7.4 kb），三載體AAVLINK遞送獲得的全長蛋白占比達(dá)83.4%±2.4%，而intein方法僅為0.2%±0.1%（圖3N–3R）。綜上，這些結(jié)果表明，與intein策略相比，AAVLINK在大基因遞送中具有顯著更高的效率和更少的副產(chǎn)物，是一種高度有效的大基因遞送方法。

4. AAVLINK介導(dǎo)的全長Shank3遞送改善Shank3突變小鼠行為缺陷

為評估治療潛力，研究團(tuán)隊(duì)首先利用AAVLINK在突變小鼠中表達(dá)Shank3。Shank3基因缺失會(huì)導(dǎo)致突觸功能障礙和自閉樣行為，而其重新表達(dá)可改善相關(guān)表型。

鑒于SHANK3基因體積較大，研究將其在c.3496位點(diǎn)拆分并分別封裝至AAVLINK載體中（圖4A），隨后注射至4周齡Shank3*InsG3680+/+小鼠的紋狀體（圖4B）。4周后，檢測到穩(wěn)定的全長Shank3蛋白表達(dá)，并通過免疫染色確認(rèn)其N端和C端完整性（圖4C、4D）。功能上，接受治療的小鼠刻板行為和運(yùn)動(dòng)能力缺陷顯著改善（圖4E、4F）。

圖4. AAVLINK介導(dǎo)的基因替代治療在PMS和Dravet綜合征小鼠模型中的應(yīng)用。

5. AAVLINK介導(dǎo)的SCN1A替代緩解Dravet綜合征小鼠癲癇表型

Dravet綜合征主要由SCN1A半量不足引起。盡管SCN1A編碼序列約6 kb，超過AAV載荷上限，但其單基因致病特性適合基因替代治療。

本研究構(gòu)建了Scn1a功能缺失小鼠模型，并觀察到穩(wěn)定的高熱誘導(dǎo)癲癇和顯著縮短的生存期。隨后，將分別攜帶SCN1A 5′端或3′端的rAAV-PHP.eB通過眶后注射共同遞送至Scn1a+/?小鼠（圖4G、4H）。結(jié)果顯示，Nav1.1蛋白在腦內(nèi)被高效重建（圖4I、4J），小鼠生存率提高，對高熱誘導(dǎo)癲癇的耐受性增強(qiáng)（圖4K）。進(jìn)一步電生理分析表明，SCN1A替代可糾正海馬錐體神經(jīng)元的高興奮性，恢復(fù)快速放電中間神經(jīng)元功能，并顯著減弱癲癇相關(guān)腦電活動(dòng)（圖4L–4P）。

總體而言，這些結(jié)果表明AAVLINK能夠在體內(nèi)穩(wěn)健遞送大尺寸治療基因。盡管系統(tǒng)給藥后腦內(nèi)共轉(zhuǎn)導(dǎo)效率相對有限，AAVLINK仍可實(shí)現(xiàn)足夠的基因重建，從而產(chǎn)生明確的治療獲益。

圖4. AAVLINK介導(dǎo)的基因替代治療在PMS和Dravet綜合征小鼠模型中的應(yīng)用。

6. AAVLINK促進(jìn)CRISPR-Cas工具的高效遞送

CRISPR-Cas技術(shù)在基因治療中的體內(nèi)應(yīng)用受限于其相關(guān)基因體積較大，常超過單個(gè)AAV的包裝容量。研究團(tuán)隊(duì)評估了AAVLINK遞送多種CRISPR-Cas工具的能力。針對長度約4.3 kb的SpCas9，研究將其在c.2682位點(diǎn)拆分并裝載至雙AAVLINK載體中（圖5A），在COS-7細(xì)胞中成功重建SpCas9，并實(shí)現(xiàn)了PSEN1基因片段的精確刪除（圖5B、5C）。

進(jìn)一步地，研究利用AAVLINK遞送兩種大體積堿基編輯器ABE8e和YE1-BE4max，分別在c.2964和c.3540位點(diǎn)拆分并遞送。在HEK293T細(xì)胞中，二者均實(shí)現(xiàn)高效蛋白重建，并在多個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生顯著的A-to-G或C-to-T編輯，最高編輯效率可達(dá)80%（圖5D–5F）。此外，AAVLINK還可遞送基于失活Cas9的轉(zhuǎn)錄調(diào)控工具。拆分遞送的CRISPRoff-V2顯著抑制多種靶基因的表達(dá)，而dSpCas9-VPH則有效激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄（圖5G–5I）。

圖5. AAVLINK介導(dǎo)的CRISPR工具遞送。

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，AAVLINK介導(dǎo)的SpCas9在小鼠肝臟Rosa26位點(diǎn)成功誘導(dǎo)雙鏈斷裂，驗(yàn)證了其體內(nèi)重建能力（圖5J）。同時(shí)，AAVLINK遞送靶向Pcsk9的ABE8e在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)約16%的A-to-G編輯并降低Pcsk9表達(dá)；遞送dSpCas9-VPH至海馬區(qū)則上調(diào)Scn1a表達(dá)（圖5K、5L）。總體而言，這些結(jié)果表明AAVLINK可在體內(nèi)高效遞送多種大型CRISPR工具，具有廣泛的應(yīng)用潛力。

7. AAVLINK2.0的開發(fā)以最小化Cre表達(dá)

外源性Cre表達(dá)在治療應(yīng)用中可能帶來生物安全性風(fēng)險(xiǎn)。為進(jìn)一步降低Cre水平，本研究在原有AAVLINK體系基礎(chǔ)上引入多重優(yōu)化策略（圖6A）。首先，在HEK293T細(xì)胞中比較了6種不同強(qiáng)度的Cre驅(qū)動(dòng)啟動(dòng)子，結(jié)果顯示SCP1啟動(dòng)子在維持EYFP高效重建的同時(shí)，僅產(chǎn)生極低水平的Cre表達(dá)（圖6B–6D），據(jù)此構(gòu)建了AAVLINK1.1。

隨后，研究通過縮短Cre蛋白半衰期進(jìn)一步增強(qiáng)其瞬時(shí)性，在Cre C端融合不穩(wěn)定化標(biāo)簽UDeg3a，使Cre在各檢測時(shí)間點(diǎn)幾乎不可檢測，且不影響目標(biāo)基因的重建效率（圖6E–6G）。采用弱啟動(dòng)子SCP1并結(jié)合不穩(wěn)定化Cre的體系被定義為AAVLINK2.0（圖6A）。

圖6. AAVLINK2.0中Cre表達(dá)的最小化。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)腦內(nèi)或靜脈遞送后，AAVLINK1.0中Cre在IHC中僅呈弱信號而在WB中不可檢測；而AAVLINK2.0在IHC和WB中均未檢測到Cre表達(dá)，同時(shí)兩種體系均可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健的目標(biāo)基因表達(dá)（圖6H–6M）。類似結(jié)果亦在食蟹猴大腦中得到驗(yàn)證（圖6N、6O）。

綜上，這些發(fā)現(xiàn)凸顯了AAVLINK2.0在生物安全性方面的顯著優(yōu)勢，有效緩解了Cre表達(dá)相關(guān)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，尤其提升了其在非人靈長類和臨床轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用前景。

8. 基于AAVLINK的大基因遞送資源庫構(gòu)建

為進(jìn)一步提升AAVLINK在大基因遞送中的應(yīng)用價(jià)值，本研究構(gòu)建了一個(gè)面向遺傳性疾病相關(guān)大基因的系統(tǒng)性資源庫，重點(diǎn)聚焦自閉癥譜系障礙（ASD）風(fēng)險(xiǎn)基因。之所以選擇ASD相關(guān)基因，主要基于以下原因：（1）ASD具有顯著的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，且目前缺乏有效治療手段；（2）多數(shù)單基因ASD病例由功能缺失（LoF）突變引起，適合開展基因替代治療；（3）相當(dāng)一部分ASD風(fēng)險(xiǎn)基因的編碼序列長度超過4 kb。

研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)檢索了SFARI Gene數(shù)據(jù)庫，克隆了所有長度大于4 kb的ASD相關(guān)基因，并同時(shí)納入了27個(gè)與其他遺傳性疾病相關(guān)的重要基因。其中包括AGL、ATP7A和OTOF，這些基因的LoF突變分別可導(dǎo)致糖原貯積癥III型、Menkes綜合征和感音神經(jīng)性耳聾。根據(jù)基因長度，這些基因被拆分并分別裝載至雙載體或三載體AAVLINK體系中，隨后在培養(yǎng)細(xì)胞中驗(yàn)證其在DNA和蛋白水平上的重建效果。

研究共將198個(gè)基因（其中193個(gè)為疾病相關(guān)基因，5個(gè)為CRISPR工具基因）克隆入AAVLINK1.0載體，隨后全部升級為AAVLINK2.0格式以增強(qiáng)治療適用性。Sanger測序證實(shí)，198個(gè)基因在HEK293T細(xì)胞中均實(shí)現(xiàn)了成功的DNA重組；其中192個(gè)基因的全長蛋白表達(dá)進(jìn)一步通過Western blot得到驗(yàn)證（圖7）。值得注意的是，大多數(shù)基因僅需單一拆分方案即可實(shí)現(xiàn)成功重建，體現(xiàn)了AAVLINK體系的穩(wěn)健性。但不同拆分策略間的重建效率仍存在差異，這一現(xiàn)象與熒光素酶實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果一致，提示對于部分基因，篩選最優(yōu)拆分位點(diǎn)可能有助于獲得最佳性能。

該資源庫的總體信息，包括基因名稱、基因長度及驗(yàn)證狀態(tài)，總結(jié)見圖7L和表S1。此外，研究團(tuán)隊(duì)還建立了專門的網(wǎng)站（http://AAVLINK.com/），以便研究者便捷獲取相關(guān)詳細(xì)信息。

圖7. 用于遺傳性疾病相關(guān)大基因遞送的AAVLINK資源庫。

利用AAV載體遞送超大基因是基因治療領(lǐng)域中的一個(gè)關(guān)鍵研究方向。盡管已有多種策略被提出以應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，但其在體內(nèi)的成功率仍然有限，效果并不理想。在本研究中，研究團(tuán)隊(duì)提出了一種名為AAVLINK的策略，使AAV能夠以高效且高度兼容的方式遞送大載荷基因。AAVLINK的主要優(yōu)勢包括：（1）相較于基于intein的蛋白重建方法和StitchR策略，具有更高的重建效率；（2）截短副產(chǎn)物極少；（3）在拆分位點(diǎn)選擇上具有更高的靈活性。此外，研究發(fā)現(xiàn)AAVLINK可在非人靈長類動(dòng)物中高效重建被拆分的基因，顯示出較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化應(yīng)用潛力。

然而，AAVLINK在治療應(yīng)用中的一個(gè)關(guān)鍵限制在于Cre的表達(dá)。盡管Cre在載體間重組后可實(shí)現(xiàn)自我失活，但在未發(fā)生重組的Cre載體中仍可能出現(xiàn)一定程度的累積。為解決這一問題，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了AAVLINK2.0，在保持穩(wěn)健重建效率的同時(shí)，將Cre表達(dá)降低至Western blot不可檢測水平，并在靈長類動(dòng)物中驗(yàn)證了其改進(jìn)后的生物安全性，進(jìn)一步增強(qiáng)了其臨床轉(zhuǎn)化潛力。此外，研究還在培養(yǎng)細(xì)胞中驗(yàn)證了AAVLINK1.0和AAVLINK2.0對198個(gè)大基因的廣泛適用性，其中大多數(shù)基因與ASD等半量不足性疾病或隱性單基因疾病密切相關(guān)。AAVLINK對這些基因的高效遞送為相關(guān)疾病的基因治療提供了新的可能。

AAVLINK遞送全長Shank3和SCN1A基因分別挽救了Phelan-McDermid綜合征（PMS）和Dravet綜合征（DS）小鼠模型中的行為和癲癇表型。尤其是，紋狀體中Shank3的替代治療同時(shí)改善了刻板行為和運(yùn)動(dòng)障礙；而全長SCN1A的遞送則顯著降低了Scn1a突變小鼠的癲癇發(fā)作頻率。AAVLINK對全長Shank3和SCN1A的成功遞送，代表了PMS和DS基因治療策略中的重要進(jìn)展。其在多種CRISPR-Cas工具遞送中的優(yōu)異表現(xiàn)，也進(jìn)一步凸顯了該體系在臨床轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用潛力。

大基因的功能缺失突變是多種神經(jīng)發(fā)育障礙的重要致病機(jī)制。對SFARI Gene數(shù)據(jù)庫的分析顯示，與ASD密切相關(guān)的功能缺失突變基因中，有37.5%的編碼序列長度超過4 kb。基于此，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一個(gè)AAVLINK資源庫，涵蓋193個(gè)與疾病相關(guān)的大基因（其中166個(gè)為ASD候選基因，27個(gè)與其他遺傳病相關(guān)）以及5種CRISPR工具，并驗(yàn)證了每個(gè)基因的DNA重組成功性，其中192個(gè)基因的全長蛋白表達(dá)也得到了確認(rèn)。這一結(jié)果充分體現(xiàn)了AAVLINK在促進(jìn)不同DNA分子重組方面的穩(wěn)健性。

綜上所述，本研究開發(fā)了AAVLINK這一高效的大基因遞送方法，其有效性已通過數(shù)百個(gè)疾病相關(guān)基因和CRISPR工具的成功遞送得到充分驗(yàn)證。

研究局限性

AAVLINK的效果仍有進(jìn)一步提升空間。首先，所有拆分基因重建策略均依賴AAV的共轉(zhuǎn)導(dǎo)，而在靈長類動(dòng)物中經(jīng)系統(tǒng)給藥后的共轉(zhuǎn)導(dǎo)效率相對較低。其次，基因拆分位點(diǎn)會(huì)影響AAVLINK的重建效率，其內(nèi)在機(jī)制尚待深入研究。第三，AAVLINK1.0中用于疾病相關(guān)基因和CRISPRoff-V2的3′ CDS載體均采用pCALM1啟動(dòng)子以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元特異性表達(dá)；若需要非神經(jīng)元表達(dá)，可使用具有廣泛表達(dá)特性的AAVLINK2.0（SCP1啟動(dòng)子），或根據(jù)需要引入自定義啟動(dòng)子。最后，對于需要細(xì)胞類型特異性表達(dá)或精確調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)水平的應(yīng)用，還需優(yōu)化5′ CDS啟動(dòng)子的選擇，因?yàn)樵搯?dòng)子在重建后是唯一發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。