使用AAV作為基因遞送載體的關(guān)鍵問題是遞送效率，而選擇適合的AAV血清型匹配其組織嗜性有助于達(dá)到理想的遞送效率。目前使用AAV載體用于基因治療面臨著以下幾大挑戰(zhàn)：首先，研究中使用的大多數(shù)AAV血清型均為天然來源，例如AAV9由于可以穿越血腦屏障而被用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基因遞送，但是這些天然血清型在組織嗜性上具有相當(dāng)程度的脫靶效應(yīng)。其次，天然AAV在人類群體中廣泛感染而導(dǎo)致人體生成的抗體會(huì)阻礙AAV載體對(duì)人體靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。即使是針對(duì)未感染過AAV的人類個(gè)體，對(duì)其輸送這些天然血清型的AAV后，經(jīng)過多次給藥，人體也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的中和抗體削弱AAV的遞送效率。另外一個(gè)關(guān)鍵問題是，這些天然AAV血清型在適用于基因治療的生產(chǎn)大規(guī)模管線上存在包裝滴度和一致穩(wěn)定性難以控制的問題，其中一些血清型可能比另一些更難生產(chǎn)出符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的AAV病毒，因此也阻礙了更多類型AAV治療載體的臨床應(yīng)用。

對(duì)于重組AAV病毒，通過改造天然AAV衣殼并進(jìn)行篩選，可以獲得靶向性更佳、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高、可避免人體內(nèi)抗體中和以及更有利于包裝生產(chǎn)的人工血清型的AAV。定向進(jìn)化(Directed evolution)是一種模擬自然選擇過程并大幅縮短進(jìn)化時(shí)間以發(fā)現(xiàn)新型高性能AAV衣殼的方式。由于定向進(jìn)化不需要具備蛋白結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)的先驗(yàn)知識(shí)，因此在發(fā)現(xiàn)新型AAV衣殼方面對(duì)比理論設(shè)計(jì)(Rational design)更具優(yōu)勢(shì)。

實(shí)施AAV衣殼定向進(jìn)化的第一步也是最關(guān)鍵一步是制備高度多樣性的AAV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒文庫，其中每個(gè)文庫質(zhì)粒上的AAV基因組含有一個(gè)rep基因和一個(gè)突變的cap基因。派真生物提供以下多種方式用于制備富含cap基因變體的AAV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒文庫：

易錯(cuò)PCR（Error-prone PCR）

易錯(cuò)PCR結(jié)合了多種次優(yōu)化的PCR條件，如使用低保真性聚合酶、更長(zhǎng)的延伸時(shí)間、更高的Mg2+濃度、添加Mn2+，以及使用不相等的多種dNTP濃度等方式來向AAV cap基因引入隨機(jī)突變。

隨機(jī)多肽展示（Random peptide display）

隨機(jī)多肽展示通常使用7到9個(gè)隨機(jī)多肽序列插入到AAV衣殼蛋白的特定位點(diǎn)，以達(dá)到改變病毒與特定細(xì)胞表面受體的天然相互作用的目的。插入的多肽一般位于AAV衣殼暴露此段多肽的位置或者介導(dǎo)病毒與細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵位置。

家族DNA洗牌（DNA family shuffling）

家族DNA洗牌將不同AAV血清型的親本cap基因碎片化，然后通過無引物PCR利用部分序列同源性將其重組為新型AAV cap基因。該方法還可以將理論設(shè)計(jì)與定向進(jìn)化相結(jié)合，即首先對(duì)天然血清型的AAV衣殼的精細(xì)結(jié)構(gòu)和序列進(jìn)行分析，然后將含有突變的cap基因片段合成為全長(zhǎng)序列，并用于組裝新型AAV衣殼。

計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)（In silico design）

現(xiàn)今已有多種計(jì)算機(jī)方法可用于預(yù)測(cè)促使AAV性能得到加強(qiáng)的衣殼序列。其中一個(gè)常用的方法是祖先衣殼重建，該法涉及多個(gè)計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)的祖先AAV衣殼文庫的構(gòu)建，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以發(fā)現(xiàn)組織嗜性得到改進(jìn)的衣殼序列。機(jī)器學(xué)習(xí)是另一種廣泛使用的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)方法，該法根據(jù)輸入的大量蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系數(shù)據(jù)來預(yù)測(cè)新型AAV病毒衣殼的組裝。

包裝AAV衣殼文庫

傳統(tǒng)一步法包裝

包裝AAV衣殼文庫的傳統(tǒng)方法是采用一步法： AAV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒文庫和腺病毒輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞。雖然這種方法被廣泛使用，但它確實(shí)存在交叉包裝(具備衣殼變異體的AAV顆粒其基因組和衣殼類型不匹配)和衣殼鑲嵌(AAV的衣殼組分來源于多種變異體)的缺點(diǎn)。為了克服這些問題，派真生物一般以極低的文庫質(zhì)粒數(shù)/細(xì)胞數(shù)比率轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，以確保單個(gè)細(xì)胞至多吸收一個(gè)文庫質(zhì)粒。

兩步法包裝

派真生物也可使用兩步法包裝病毒文庫。在這種方法中，衣殼文庫首先與編碼野生型cap基因但缺少病毒ITR的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞中。這將產(chǎn)生帶有鑲嵌型衣殼的AAV顆粒，這種部分由野生型VP蛋白組成的衣殼被稱為AAV轉(zhuǎn)移穿梭機(jī)(AAV transfer shuttle)。將此種AAV以低感染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞至多感染一個(gè)病毒顆粒。隨后用野生型腺病毒對(duì)包裝細(xì)胞進(jìn)行雙重感染，最終產(chǎn)生高滴度病毒衣殼文庫。

AAV衣殼文庫篩選

成功構(gòu)建AAV衣殼文庫后，為富集期望的AAV血清型，根據(jù)篩選目的病毒衣殼文庫通常需要經(jīng)過在體外或者體內(nèi)的多次篩選。派真生物使用包括非人靈長(zhǎng)類(Non-human primate，NHP)在內(nèi)的多種模式生物進(jìn)行體內(nèi)篩選，如小鼠、大鼠、以及重要的兩種非人靈長(zhǎng)類：食蟹猴(Macaca fascicularis)和獼猴(Macaca Mulatta)。派真生物的所有體內(nèi)篩選試驗(yàn)均在經(jīng)過AAALAC認(rèn)證的機(jī)構(gòu)中以專業(yè)認(rèn)可的方式進(jìn)行。

體外篩選

利用已建立的細(xì)胞系篩選AAV衣殼文庫是一種常用的體外篩選方法，特別是用于發(fā)現(xiàn)靶向受體能力發(fā)生變化的AAV衣殼變體。AAV文庫的體外篩選快速且技術(shù)簡(jiǎn)單，但是也存在一定的問題。首先，針對(duì)體外高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率優(yōu)化的載體在體內(nèi)使用時(shí)可能無法重現(xiàn)相同的效率。其次，在體外表現(xiàn)出對(duì)靶細(xì)胞高度特異性的AAV載體在體內(nèi)時(shí)可能會(huì)轉(zhuǎn)導(dǎo)非靶組織。體外篩選AAV文庫的另一種策略是在感染靶細(xì)胞之前，將AAV文庫加入免疫動(dòng)物的強(qiáng)效血清中以辨別具有免疫逃避屬性的衣殼變體。然而，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)不同衣殼變體的AAV引發(fā)免疫反應(yīng)的類型也可能不一致(即使同一種AAV載體，通過不同途徑輸送也可能會(huì)產(chǎn)生不同的免疫反應(yīng))。

體內(nèi)篩選

體內(nèi)動(dòng)物模型為篩選AAV文庫提供了更可靠的平臺(tái)，特別是用于尋找那些需要轉(zhuǎn)導(dǎo)體外難以培養(yǎng)的細(xì)胞的或者需要轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)中的特定細(xì)胞的AAV突變體。體內(nèi)篩選還有助于發(fā)現(xiàn)與AAV突變體相關(guān)的任何的潛在脫靶效應(yīng)。小鼠和NHP均廣泛用于AAV文庫的體內(nèi)篩選，但是NHP模型由于與人類的高度相似，因此是篩選與臨床應(yīng)用相關(guān)的改良型AAV載體的最佳平臺(tái)。