一、什么是慢病毒包裝？
由于在一些細胞相關實驗中，有些細胞難以用常規方法轉染，通常通過慢病毒感染的方式將靶基因隨機整合到宿主的基因組中，從而增加轉染效率，并且能夠在細胞系中穩定表達若干代，可進行穩定細胞株的篩選。目前，慢病毒已廣泛用于基因功能研究、RNA干擾、小分子RNA研究以及活體動物實驗中，成為基因治療的有力工具之一。
圖1 慢病毒載體的基因組和結構(Dong W, Kantor B,. 2021)。(A) 野生型人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基因組的簡化示意圖 (B) 慢病毒粒子結構。
二、慢病毒包裝的原理
攜帶外源基因的慢病毒載體與包裝載體一同轉染包裝細胞，即可進行病毒的包裝。包裝好之后分泌到細胞外的培養基中，經過離心取得上清液，再濃縮后的慢病毒液可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經過逆轉錄，整合到細胞基因組，從而實現外源基因在宿主細胞中的表達。
圖2 慢病毒包裝示意圖(Maes et al,. 2019)。
三、慢病毒載體
目前實驗室應用最廣泛的慢病毒載體(Lentiviral vectors，LVs)是以人類免疫缺陷型病毒(HIV)為基礎發展起來的載體，其中HIV-1/HIV-2系統已得到了廣泛應用。要想包裝出一個完整病毒，我們一般需要如下幾個質粒：(1)一個轉移質粒;(2)一個或兩個包裝質粒;(3)一個包膜質粒。
(1)轉移質粒：包含用于復制/轉錄和包裝的順式作用序列。其中包含的啟動子可促使任何感興趣的基因均以細胞類型特異性或非特異性方式表達。
(2)包裝質粒：提供結構和RT蛋白(Gag-Pol)。
(3)包膜質粒：編碼一種糖蛋白來假型化載體顆粒，該過程包括在病毒脂質包膜中摻入異源ENV。最常用的ENV之一是水皰性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)，其賦予載體穩定性以及廣泛的細胞趨向性。
圖3 反式互補生產LVs(Mátrai et al., 2010)。
四、慢病毒包裝的實驗步驟
(1)構建含有目的基因的慢病毒載體。
(2)大量擴增慢病毒載體：根據實驗將包裝慢病毒過程中需要用到的3個質粒進行高純度無內毒素抽提。
(3)293T細胞內進行慢病毒載體的大量包裝：按一定比例將轉移質粒、包裝質粒和包膜質粒共轉染指數生長期的293T細胞。
(4)慢病毒的濃縮及純化：PEG8000濃縮法/蔗糖密度梯度超速離心法。
(5)慢病毒滴度測定：采用GFP熒光計數、絕對定量qPCR和RT-qPCR等進行慢病毒滴度測定。
圖4 293T細胞慢病毒包裝過程(E Martínez-Molina et al., 2020)。
五、慢病毒包裝優勢
1、感染譜廣：大量文獻研究表明，慢病毒載體介導的目的基因可在不同的組織或細胞中包括腦、肝臟、肌肉、視網膜、造血干細胞、骨髓間充質干細胞、巨噬細胞等長期表達。
2、穩定表達：相比瞬時轉染，慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，并且可以穩定持續表達。
3、適用范圍廣：不僅能用于體外實驗，還能用于活體動物模型，尤其是動物成瘤實驗。
4、免疫原性低：慢病毒載體不表達任何HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位無細胞免疫反應，體液免疫反應也較低，不影響病毒載體的第2次注射。
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