圖1 慢病毒的典型形態

慢病毒載體的結構

1）野生型HIV-1的基因結構

作為慢病毒載體的改造基礎，我們首先了解一下野生型HIV-1的基因結構。HIV-1病毒基因組是由兩條正鏈的RNA組成，長度約為9Kb左右，兩端是長末端重復序列(LTR)，兩個LTR之間的序列為編碼蛋白的序列，由9個基因所構成(圖2)。

圖2 野生型HIV-1的基因結構

9個基因按照編碼的蛋白重要性不同，可以分成三類

◆??編碼三種主要病毒結構蛋白的基因：gag、pol和env。gag基因編碼病毒的核心蛋白如核衣殼蛋白、內膜蛋白和衣殼蛋白;pol基因編碼病毒復制相關的酶;env基因編碼病毒包膜糖蛋白。

◆??編碼兩個調節蛋白的基因：tat、rev。rev主要參與蛋白調節的表達水平，tat參與蛋白轉錄的控制，與病毒的長末端重復序列(long terminalrepeats,LTRS)結合后促進病毒的所有基因的轉錄。

◆??編碼四個輔助蛋白的基因：vif、vpr、vpu、nef。在HIV-1的基因組結構上，還含有病毒生命史所需要的其他序列結構，例如病毒復制和包裝等所需要的信號等。

2）慢病毒載體

慢病毒載體則是以慢病毒基因組為基礎，對慢病毒自身的元件，如LTR，Gag，Pol，Env等進行改造而發展起來的一類能夠攜帶外源基因的病毒載體。

根據其來源主要有以下幾種類型:HIV-1型( human immunodeficiency virus type1)載體系統, HIV-2型( human immunodeficiency virus type2)載體系統, 猿類免疫缺陷病毒( simian immunodeficiency virus,SIV) ,貓免疫缺陷病毒( felines immunodeficiency virus, FIV)等，其中HIV-1 型載體系統研究得最為廣泛和深入。

慢病毒載體的發展過程

為了避免有復制能力病毒(RCV)的產生，在構建HIV-1型病毒載體時一般將HIV-1基因組分裝于幾個質粒載體中，再共轉染細胞，然后獲得只有一次感染能力而無復制能力的HIV-1載體顆粒。到目前為止，慢病毒載體的設計大約經歷了以下幾個階段。

1）兩質粒系統

以HIV-1為骨架，將其中的反式作用蛋白基因序列去除，然后包裝成為含有目標基因的重組質粒和能夠反式提供病毒顆粒所需蛋白的包裝質粒，共轉染包裝細胞(如293T細胞)進行包裝。兩質粒系統為復制缺陷型載體，僅能獲得較低的滴度，且僅能感染CD4+的靶細胞，并存在產生野生型HIV的嚴重危險。

2）三質粒系統

將HIV-1基因組中負責包裝，逆轉錄和整合所需要的順式作用序列結構和編碼反式作用蛋白的序列分離，再克隆到三個獨立的質粒中，并去除了所有的輔助序列。極大地增加了病毒的安全性，是目前比較常用的慢病毒包裝系統。三質粒的結構如圖3所示。

圖3 三質粒HIV-1病毒包裝系統

◆?包裝質粒（Packaging plasmid）：含有CMV啟動子，控制gag，pol，tat，rev基因的表達，編碼部分結構蛋白和調節蛋白。

◆??包膜質粒（Envelope plasmid）：含有表達水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)基因的序列，這個基因用于代替原病毒的env基因，這個基因的產物，可以提高病毒的宿主范圍。

◆??載體質粒（Transfer plasmid）：其中含有病毒LTR以及研究人員所感興趣的基因序列結構。不過需要注意的是，載體質粒的表達依賴包裝質粒中tat基因的啟動。

4）四質粒系統

四系統是在三質粒系統的基礎上改進而來的，也是目前較為常用的病毒系統。與三質粒系統相比，第一個變化是將rev基因放在一個單獨的表達質粒上，新增一個質粒更增加了系統的安全性。第二個變化是將tat基因去除，并在載體質粒上增添了與異源啟動子融合的嵌合5’LTR，以啟動載體質粒的表達。這樣就形成了四個質粒的系統，即pGag/Pol、pRev、pVSV-G。此外，還有一個可以放置目的基因序列的載體。這個體系意外產生活性病毒的可能被大大降低。四質粒的結構如圖4所示。

圖4 四質粒HIV-1病毒包裝系統

慢病毒載體的應用

與其他逆轉錄病毒相比，慢病毒有其獨特的優點：

◆有更廣泛的宿主，對于分裂和非分裂細胞均具有感染能力。對于一些較難轉染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，能大大提高目的基因轉導效率，使目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加。

◆??穩定表達。慢病毒可以將外源基因有效的整合到細胞染色體中，且目的基因對轉錄沉默作用有一定的抵抗能力，可以在靶細胞中得到持續高效穩定的表達。

◆??經過構建后的慢病毒載體可以攜帶大約5kb，甚至更長的目的基因。因此除了外源的short-hairpin RNAs(shRNAs)等小分子外，很多cDNA也能被克隆進入慢病毒載體，當然隨著目的基因長度的增加，其病毒滴度也會隨之下降。

基于慢病毒的優點，可以利用慢病毒載體系統進行轉染目的基因或RNAi基因的常規實驗操作，同時慢病毒在基因編輯、基因治療、轉基因動物、藥物研究等領域也發揮著重要作用。