杜氏肌營養不良癥（Duchenne Muscular Dystrophy, DMD）?是最常見的 X?連鎖隱性致死性肌肉疾病，全球男性新生兒中的發病率約 1/3500–5000。核心病因是 DMD基因突變導致肌萎縮蛋白（dystrophin）缺失或功能缺陷，最終出現進行性骨骼肌與心肌退行性病變。目前臨床上尚無根治方法，患者通常在20-30歲因呼吸衰竭或心臟并發癥死亡。開發有效的基因治療策略，恢復肌萎縮蛋白的表達，是當前DMD研究的前沿熱點。

對DMD臨床前研究長期受限于缺乏與人類生理解剖高度相似的大型動物模型。目前常用的小鼠、犬、豬模型都不能完全模擬患者病程，制約了療效和安全性評估的可信度，而建立大型靈長類模型通常需要 6–7 年的時間。

2025年4月，昆明理工大學陳永昌/季維智和解放軍總醫院吳士文團隊在Cell Reports Medicine雜志（醫學1區Top期刊，IF=10.6）發表了一項突破性研究成果，研究團隊通過 CRISPR/Cas9 一步法定點敲除?DMD?Exon50，構建出全球首個Exon50突變的DMD恒河猴模型，將建模周期直接壓縮到?< 1?年。該模型高度模擬人類DMD的核心病理特征和典型的運動功能障礙，為疾病研究提供了理想的實驗平臺。基于這一優質的猴模型，研究人員設計了一種靶向Exon51的單側切割基因治療策略，顯著恢復了抗肌萎縮蛋白表達，有效改善了模型動物的病理損傷和運動功能，在DMD猴模型中療效持續1.5年以上，為DMD的臨床基因治療提供了關鍵的科學依據和極具轉化前景的治療方案。

研究亮點

1. 全球首個Exon50突變的DMD恒河猴模型。研究團隊采用一步法構建了杜氏肌營養不良恒河猴模型，該模型比小鼠模型更接近人類疾病特征，為轉化醫學研究提供了更可靠的實驗平臺。

2. 單剪切基因治療策略。?研究采用了單剪切（Single-cut）基因編輯策略，這種方法較傳統雙剪切策略具有更高的效率和安全性，減少了脫靶風險。

3. 長期治療效果可持續至少1.5年。研究團隊利用腺相關病毒（AAV）載體系統遞送肌萎縮蛋白（micro-dystrophin）基因編輯系統，實現了高效的基因表達和組織靶向。單次給藥的治療效果可持續至少1.5年，無嚴重不良反應，為臨床應用提供了重要依據。

主要研究結果

1. Exon50突變DMD恒河猴模型的構建

研究團隊設計了靶向DMD基因50號外顯子剪接供體位點的sgRNA，通過胚胎顯微注射和代孕移植，最終獲得6只活產猴，包含4只50號外顯子突變的猴模型（1雌3雄）。分子水平檢測顯示，所有突變猴均在51號外顯子中引入提前終止密碼子，導致dystrophin完全缺失（圖1）。DMD^Exon50突變猴模型表現出與人類DMD患者高度相似的病理特征，包括肌肉組織無dystrophin表達、肌肉纖維化、CK升高、步態異常、運動能力下降等典型DMD癥狀。

圖1. DMDEx50猴模型的構建與表征。

(A) 靶向DMD基因第50號外顯子的基因編輯策略示意圖。(B) 用于靶向猴DMD基因第50號外顯子的sgRNA位點位置示意圖。(C) DMD^Ex50猴模型的生成過程示意圖。(D) DMD^Ex50猴模型信息。(E) 四只DMD^Ex50模型猴的照片。(F) 肌肉DNA中的突變類型與序列：紅色堿基為插入序列，虛線表示缺失序列。(G) 肌肉mRNA中的突變類型與序列：紅色堿基為插入序列，虛線表示缺失序列；終止密碼子用綠色下劃線加星號標注。(H) WT與DMD^Ex50猴外周血DNA PCR瓊脂糖凝膠電泳結果。(I) Western blot顯示1歲WT和DMD^Ex50猴股四頭肌中Dystrophin的表達。(J) 1歲WT和DMD^Ex50猴股四頭肌Dystrophin和Laminin的免疫熒光染色。

2. 單剪切基因治療策略和治療效果

為糾正DMD基因第50號外顯子的突變，研究團隊設計了靶向剪接受體位點的sgRNA，并從中篩出sgRNA3和sgRNA4兩條高活性sgRNA。體外測試顯示，這兩條sgRNA的總編輯率分別達到48.67%和40.37%，其中能恢復閱讀框的“有效編輯”占比依次為16.43%和13.70%。由于人類與恒河猴在DMD基因第51號外顯子的序列完全一致，因此這些sgRNA無需修改即可用于人類。后續在人類HEK293T與HeLa細胞中的驗證也印證了這一點：sgRNA3在這兩種細胞系中的總編輯率分別為53.65%和30.95%，跨物種兼容性良好。

在此基礎上，研究團隊進一步構建了肌肉特異性的MyoAAV遞送平臺，引入僅有1056個氨基酸的緊湊型核酸酶Cas12i^Max，采用巨細胞病毒強啟動子（CMV）驅動表達的單載體治療方案MyoAAV-Cas12i^Max-sgRNA3^Ex51。在臨床前試驗中，局部肌內注射后不同肌群的表現差異明顯：腓腸肌的總編輯率與有效編輯率分別達到7.50%和1.12%，而肱三頭肌僅為1.55%和0.17%（圖2）。更有趣的是，mRNA層面的編輯比例遠高于DNA層面，暗示可能存在轉錄后調節機制。

圖2. MyoAAV-Cas12iMax-sgRNA3Ex51在體內外均實現高效編輯。

(A) DMD^Ex50突變與基因編輯策略示意圖。第50號外顯子缺失導致閱讀框移碼，并在第51號外顯子提前出現終止密碼子。設計策略通過重排或跳過第51號外顯子以恢復dystrophin蛋白的正確閱讀框。(B) 針對DMD^Ex50猴模型第51號外顯子的sgRNA設計方案。圖中列出sgRNA1–sgRNA4的序列及其對應的PAM位點。(C) 四種sgRNA（sgRNA1–sgRNA4）在DMD^Ex50猴模型中誘導的基因組插入/缺失（indels）。將每種sgRNA分別構建到Cas12iMax質粒中，并轉染COS-7細胞，隨后進行單克隆測序。恢復DMD基因閱讀框的編輯視為有效（粉色），其余為無效（藍色）。數據以平均值±標準誤表示。(D) 人類與猴子第51號外顯子序列比對，顯示sgRNA3和sgRNA4的靶向區域高度保守。圖中標記了sgRNA3和sgRNA4的靶位點，表明其具備跨物種編輯潛力。(E) sgRNA3的體外編輯效率驗證。細胞轉染sgRNA3與Cas9質粒（+）或對照質粒（-）。PCR擴增目標區域后行凝膠電泳，發現轉染sgRNA3（+）的細胞出現切割條帶（下方條帶），表明Cas9成功介導基因組編輯；野生型（WT，無sgRNA3）未出現切割產物，證明sgRNA3介導的編輯具有特異性。(F) sgRNA3在HEK293T和HeLa細胞中誘導的基因組indels定量分析，分別展示有效（粉色）與無效（藍色）編輯比例。(G) 用于靶向基因編輯的MyoAAV-Cas12i^Max-sgRNA3載體示意圖。CMV：巨細胞病毒啟動子；NLS：核定位信號/序列；U6：人U6啟動子。(H) 肱三頭肌（TB）與腓腸肌（GM）局部肌肉注射MyoAAV-Cas12i^Max-sgRNA3^Ex51后，DNA水平的編輯效率。圖表顯示有效（粉色）與無效（藍色）編輯比例，數據以平均值±標準誤表示。(I) 注射后2周，TB與GM肌肉中mRNA水平的編輯效率。圖表顯示有效（粉色）與無效（藍色）編輯比例，數據以平均值±標準誤表示。

隨后，研究團隊通過靜脈注射 MyoAAV-Cas12i^Max-sgRNA3^Ex51，對17 月齡的 DMD^ΔEx50猴進行了系統性基因治療（圖3）。結果顯示：（1）在 DNA 層面，不同肌肉的編輯率存在差異，肱三頭肌（TB）與肱二頭肌（BB）在 8 周至 1 年內始終保持在 2.42–3.28% 的總編輯水平；（2）mRNA水平的總編輯率遠高于 DNA 水平；（3）載體轉導效率穩定，治療?35?周后仍能檢測到高水平信號。耐人尋味的是，盡管 1.5 年后在分子層面已難以檢測編輯的痕跡，TB 肌肉中仍有 7.58% 的細胞呈抗肌萎縮蛋白陽性，暗示可能存在某種長期蛋白維持機制。

Western blot 和免疫染色進一步證實，該策略能夠持續恢復蛋白表達。8 周時，TB 的陽性肌纖維比例最高，達 45.16%，隨后隨時間推移略有下降，但 35 周時 BB 仍有 32.16% 的陽性率。到 1.5 年時，TB 仍可檢測到 7.58% 的陽性信號。

組織學分析顯示，治療后的猴子表現出明顯的病理改善，包括肌纖維結構恢復、壞死減少、纖維化程度降低等。功能測試證實，治療猴的核心肌群力量明顯增強，在最具挑戰性的仰臥位測試中，5秒內自主站立成功率顯著提高。

圖3.?系統性遞送MyoAAV-Cas12iMax-sgRNA3Ex51在DMDΔEx50猴模型中恢復dystrophin蛋白表達。

(A) DMD^ΔEx50猴治療實驗時間軸。圖中標示免疫抑制劑給藥方案及肌肉活檢時間點。SID：每日一次；BID：每日兩次；PO：口服。(B 和 C) 治療后不同時間點多種肌肉組織的DNA水平(B)和mRNA水平(C)編輯率。圖中分別展示有效編輯（粉色）與無效編輯（藍色）比例。(D) 治療后肌肉組織中的載體基因組拷貝數。以每毫克DNA的載體拷貝數表示不同肌肉組織在各時間點（治療前、8周、35周、1年、1.5年）的檢測結果。檢測的肌肉包括股四頭肌（QD）、左肱三頭肌（L-TB）、三角肌（DT）、左肱二頭肌（L-BB）、右肱二頭肌（R-BB）和脛骨前肌（TA）。數據以平均值±標準誤展示，每個圓點代表一個獨立樣本。(E 和 F) 治療前后多種肌肉組織dystrophin（Dys）蛋白表達的Western blot分析。以野生型（WT）和未治療的DMD^ΔEx50樣本作對照。每孔上樣50 μg總蛋白。為方便比較，WT樣本按不同比例上樣，如WT(10%)表示上樣5 μg（占50 μg的10%）。Vinculin（Vin）作為上樣內參。(G) 不同時間點及不同肌肉部位的肌肉切片dystrophin（綠色）與細胞核（DAPI，藍色）免疫熒光染色。(H–K) 各肌肉部位及時間點的dystrophin陽性細胞定量：(H) 治療后8周的股四頭肌（QD）、肱三頭肌（TB）和三角肌（DT）；(I) 治療后35周的肱二頭肌（BB）；(J) 治療后1年的肱二頭肌（BB）和脛骨前肌（TA）；(K) 治療后1.5年的肱三頭肌（TB）。

3. 治療的長期效果和安全性

研究結果顯示，單次基因治療可產生持續至少1.5年的治療效果，同時未觀察到明顯的免疫毒性或其他不良反應。通過全基因組測序和擴增子測序對潛在脫靶效應進行系統評估，結果顯示，在允許至多3個錯配的嚴格條件下，僅檢測到極少數單核苷酸變異（SNVs），且主要位于非編碼區。

本研究對行業和臨床的啟示

本研究首次在靈長類動物中實現了DMD的快速建模與高效基因治療驗證，為DMD患者提供了具有臨床轉化潛力的“單切、單載體、系統性”治療策略，標志著基因編輯治療DMD邁出關鍵一步。

本研究中使用的AAV載體信息：

派真生物有幸為本研究提供了AAV病毒包裝服務，助力該突破性研究成果的產生。